分離媒体の製造方法

专利摘要:
本発明は、スピニングディスク技術を用いて分離媒体を製造するための方法に関し、ビーズの空隙率は、複雑な試料から所望の生体分子を分離できるように最適化される。本方法は、ａ）粘度３５０〜４５０ｍＰａｓの４〜８％多糖類溶液を、６５〜７５℃で３００１〜３０１０ｒｐｍの１以上のスピニングディスクに供給して多糖類ビーズを形成する工程と、ｂ）生成した多糖類ビーズを捕集浴中に捕集する工程であって、捕集温度を１５〜２７℃で変化させることによって多糖類ビーズの空隙率を制御する工程とを含む。本方法によって、１５００００ｇ／ｍｏｌよりも大きな分子がビーズ内に拡散するのを阻止する空隙率が得られる。本発明は、本方法で製造された分離媒体及び生体分子、特にモノクローナル抗体の精製のための使用にも関する。
公开号:JP2011511288A
申请号:JP2010544924
申请日:2009-01-30
公开日:2011-04-07
发明作者:グラド，ギュナー；ステンホルム，エケ；ノルマン，ニルス；マヨイセル，ジャン・リュック；ヨハンソン，ボ・レナート
申请人:ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ；
IPC主号:G01N30-88

专利说明:

[0001] 本発明は、クロマトグラフィーの分野に属する。より正確には、本発明は、いわゆるスピニングディスク技術を用いて、複雑な試料から所望の生体分子を分離することができるようにビーズの空隙率を選択し得る分離媒体を製造する方法に関する。]
背景技術

[0002] バイオテクノロジーで、最も広く使用される分離方法の１つはクロマトグラフィーである。用語クロマトグラフィーは一群の密接に関連した分離方法を包含する。クロマトグラフィーを他の殆どの物理的及び化学的な分離方法から区別する特徴は、１つの相が固定され、他の相が移動性である相互に不混和性の２つの相を接触させることである。移動相中に導入された試料混合物は、移動相によって系内を運搬される間一連の相互作用を受け、すなわち固定相と移動相との間に分配される。相互作用は試料中の成分の物理的又は化学的な性質の差を利用する。これらの差は、固定相を含有するカラムを通って移動する移動相の作用下での個々の成分の移行の速度を決定する。分離された成分は、それらと固定相との相互作用に応じて一定の順に出現する。最も遅れの少ない成分は最初に溶出し、最も強く保持された物質は最後に溶出する。分離は、試料成分がカラムから溶出する際、１つの成分が、隣接する溶質のゾーンとの重なりを妨げるのに十分なほど遅らせられたときに得られる。]
[0003] 今日までに提案されたクロマトグラフ法は標的との様々な様式の相互作用に基づいている。例えば、イオン交換クロマトグラフィーの場合官能基は反対の電荷の対イオンをもつ永久的に結合したイオン性の基であり、一方疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の場合固定相と分離される成分との間の相互作用は疎水性に基づいている。その他のクロマトグラフの分離原理も当業者には周知である。]
[0004] 分離マトリックスともいわれる固定相は、一般に複数の本質的に球状の粒子である支持体、及びこの支持体に結合したリガンドを含んでいる。殆どの分離マトリックスの場合支持体は多孔性であって、各粒子はより多くの量のリガンド、従ってより多くの結合した標的化合物を含むことができる。支持体は殆どの場合天然又は合成のポリマーであり、球状の粒子は多くの異なる方法で製造することができる。この目的で使用されることが多い天然のポリマーは多糖類のデキストランとアガロースである。]
[0005] スピニングディスク技術を用いてアガロースビーズを形成することができる。この技術は回転するディスクを含んでおり、その中心に適切な条件下で液体を供給し、その縁部に向かって遠心力をかける。ディスク縁部は液滴を作成するために歯状になっている。この技術を使用することにより、ディスクの縁部で均一な大きさの液滴が作成される。均一な大きさの液滴の噴霧スプレー、霧ミスト及び油を製造するためにスピニングディスク技術を使用することは確立された手法である。Ｗａｌｔｅｒ及びＰｒｅｗｅｔｔ（Ｗａｌｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．；Ｐｒｅｗｅｔｔ，Ｗ．Ｃ．（１９４９）Ｐｒｏｃ．Ｐｈｙｓ．Ｓｏｃ．Ｂ．６２，３４１−３５０）は１９４９年の早期に、噴霧液滴の大きさが概ね次式（１）で与えられると結論した。]
[0006] 式中、ｄ＝液滴直径、Ｄ＝ディスク直径、ω＝ディスクの角速度、Ｔ＝液体の表面張力、ρ＝液体の密度である。]
先行技術

[0007] 国際公開第２００６／０３３６３４号]
発明が解決しようとする課題

[0008] クロマトグラフ及びバッチ式の手法により生体分子を分離するには、ビーズの空隙率(porosity)が極めて重要である。ポリマー性媒体の１つの利点は広範囲にわたって孔径を変動させられる機会があることである。文献を通じて受け入れられている一般原則は、大きい分子には大きい孔径を有する媒体を使用することである。これらの細孔における物質移動は対流ではなく拡散過程の結果である。選択的な媒体を得るには、狭い孔径分布を有する空隙率を得ることが望ましいであろう。スピニングディスク技術を用いてアガロースビーズを製造する際には、一定の選定された大きさを超える分子、例えばモノクローナル抗体を排除するようにビーズの空隙率を最適化することができる手法を使用するのが望ましいであろう。]
課題を解決するための手段

[0009] 本発明は、ビーズを透過する小さい分子に対するビーズの相互作用を最大化し、かつビーズを透過しない大きな分子に対するビーズの相互作用を最小化するスピニングディスク媒体の空隙率を制御することを目的とする方法を提供する。媒体はアガロースを主体とするのが好ましく、スピニングディスク媒体の製造方法はモノクローナル抗体のような大きいタンパク質を排除する空隙率を有するビーズが得られるように最適化される。]
[0010] ヒト化型モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は生物医薬として極めて有望である。ｍＡｂの精製で直面する１つの最も重要な課題は細胞培養培地中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から分離ことである。本発明により、純粋なｍＡｂを不要なＨＣＰから分離することが可能になる。]
[0011] 好ましくは、スピニングディスク媒体をさらに加工処理していわゆる蓋(lid)媒体にする、すなわち、スピニングディスク法で得られたビーズがビーズのコアを構成し、コアとは別の組成の蓋又は外層がコアを覆う。]
[0012] 第１の態様では、本発明は、スピニングディスク法でポリマービーズを選択的に製造する方法を提供する。ここで、ビーズは１５００００ｇ／ｍｏｌよりも大きな分子がビーズ中に拡散するのを阻止する空隙率を有しており、この方法は以下の工程：
ａ）３５０〜４５０ｍＰａｓの粘度を有する４〜８％の多糖類溶液を、６５〜７５℃において、３００１〜３０１０ｒｐｍで１以上のスピニングディスクに供給して多糖類ビーズを形成する工程と、
ｂ）生成した多糖類ビーズを捕集浴中に捕集する工程であって、捕集の温度を１５〜２７℃、好ましくは１７．５〜２４．６℃で変化させることによって多糖類ビーズの空隙率を制御する工程と
を含む。]
[0013] 上記のパラメーターは、所望の限界、すなわちモノクローナル抗体のような１５００００ｇ／ｍｏｌよりも大きな分子をビーズ中に拡散させる限界にビーズの空隙率を制御するために必須である。]
[0014] 多糖類ビーズはアガロース、カラゲナン、デキストラン、アルギン酸塩、ペクチン、デンプン及びガラクトマンナンから選択されるのが好ましい。かかる多糖類は冷却すると自発的に物理的に架橋された網目構造を形成することが知られている。]
[0015] 好ましくは、多糖類ビーズはアガロースからなり、工程ａ）のアガロース溶液は６５〜７５℃、好ましくは約７０℃で、３５０〜４５０ｍＰａｓ、好ましくは３９７〜４２１ｍＰａｓの粘度をもつ４〜８％、好ましくは６％のアガロース溶液である。]
[0016] モノクローナル抗体の精製に関して、１５００００ｇ／ｍｏｌよりも大きな分子がビーズ中に拡散するのを阻止する空隙率が選択される。]
[0017] 好ましくは、工程ａ）において多糖類溶液を１以上のスピニングディスクに供給するには、１２０〜１７０ｍＬ／ｍｉｎの流速とする。]
[0018] 好ましい実施形態では、多糖類溶液は、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル、ジビニルスルホン、エポキシ活性化（例えば、後記実施例に記載するようなアリル化及び臭素化）又はその他当業者に公知のいずれかの活性化方法などによって活性化される。]
[0019] 多糖類ビーズは、より剛性のビーズを得るために、工程ｂ）の後に架橋してもよい。]
[0020] 好ましくは、多糖類ビーズは、工程ｂ）の後に蓋又は外層を備える。好ましい実施形態では、多糖類ビーズは、アリル化し、かつ部分的に臭素化し、さらにＮａＯＨで処理してコア多糖類ビーズ上に蓋を形成する。]
[0021] 好ましくは、コア多糖類ビーズはリガンドを備えているが、蓋はリガンドを備えていない。蓋は大きな分子がコア多糖類ビーズ上のリガンドと反応するのを阻止する。これは、不要なタンパク質とコアリガンドとの間の相互作用を最適化するように移動相を選定することができる点、及び目的のタンパク質がコアリガンドにより捕集されるおそれがないという点において１つの利点である。従って、クロマトグラフ分離のために任意の移動相を、又はバッチ式の分離のために任意の上清を選択し得る。例えば、リガンドとＩｇＧ（モノクローナル抗体）との間の相互作用を完全に排除することができる。これは、大きい分子を細孔内に捕集することが望ましい従来技術とは異なるアプローチである。本発明者が、目的の分子から不要の分子を非常に厳格に排除する空隙率、すなわちビーズ内部の目的の分子又はフロースルー若しくは上清中の不必要な分子の重なりが全くない空隙率を見出すことができたということは驚くべきことであった。]
[0022] アニオン交換、カチオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用又はこれらの任意の組合せのようなあらゆるタイプのリガンドをビーズのコアに結合させることができる。リガンドは場合によりエキステンダーを備えていてもよい。]
[0023] 好ましくは、リガンドはイオン交換リガンドである。]
[0024] 好ましい実施形態では、イオン交換リガンドは、多糖類ビーズ及びリガンドからの距離を増大し、リガンドへのアクセス可能性を改良し、並びにリガンド密度を増大するためにエキステンダーを備えた弱アニオン交換リガンドである。]
[0025] 第２の態様では、本発明は、上記方法に従って製造され、リガンドがイオン交換体、好ましくはエキステンダーを備えた弱アニオン交換体である分離媒体を提供する。]
[0026] 好ましい実施形態では、多糖類はアガロースであり、弱アニオン交換体はＤＥＡＥであり、エキステンダーはデキストランである。]
[0027] 第３の態様では、本発明は、所望の生体分子を不要な生体分子からクロマトグラフ又はバッチ式に分離するための、本発明の分離媒体の使用に関する。]
[0028] １つの実施形態では、不要な分子はビーズ中に拡散するが、所望の分子はビーズ中に拡散しない。この場合、所望の生体分子はＩｇＧ若しくはモノクローナル抗体又はウィルス若しくはプラスミドのような他の大きく所望の生体分子であり得る。]
[0029] 本発明はモノクローナル抗体の精製のようなバイオプロセス用途に限定されることはなく、例えば体液のプロテオミック分析用の試料の調製に使用することもできる。]
[0030] 別の実施形態では、所望の分子がビーズ中に拡散するが、不要な分子は拡散しない。この場合、所望の分子はバイオマーカーのような分子量＜６００００ｇ／ｍｏｌの存在量の少ないタンパク質である。このような存在量の少ない希少タンパク質はその後例えば２Ｄ電気泳動でさらに精製され、好ましくはＬＣ−ＭＳを用いて分析される。]
図面の簡単な説明

[0031] 図１は、スピニングディスク技術を用いたアガロースビーズの生成を説明する概略図である。ドーム＝落下する液滴を取り囲む閉鎖空間。捕集＝水を充填した鉢で、ここでゲル化が起こる。
図２は、スピニングディスクビーズ（プロトタイプＱ１、Ｑ２及びＱ３、下記参照）の活性化及びリガンド（ＴＭＡ＝−Ｎ+（ＣＨ3）3）結合手順の説明図である。
図３は、ビーズのコア内でＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＥＡＥ−ＤＸ）により置換されたプロトタイプの解説図である。] 図１ 図２ 図３
[0032] スピニングディスク技術を用いたアガロースビーズの生成において、回転速度は一定の大きさを有するビーズを実現するための重要な可変量である。架橋されたビーズは分離目的に使用することを目的とするが、最終的なゲル構造はその空隙率の特徴を決定付けるので、ビーズのゲル化機構には興味がある。周知のように、アガロース溶液の冷却速度が速いと、感知できるほどの量の秩序のある凝集体が生成する前に相分離が起こり、その結果空隙率の質は悪くなる。ビーズの孔径はまた使用するアガロース溶液の濃度にも依存する。濃度が低下するにつれて孔径は増大する。]
[0033] 実験の部
以下の実施例は解説の目的のみで挙げるものであり、特許請求の範囲により定められる本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中以下及びその他で参照する文献は全て援用により本明細書の内容の一部をなす。]
[0034] 実施例１：スピニングディスク媒体の調製
６％アガロース溶液を出発材料として使用した。温度、冷却速度、粘度、速度及びアガロースの流速（ディスクに対する）を空隙率応答(porosity response)に関して検討した。スピニングディスク法の概略図を図１に示す（従来技術）。] 図１
[0035] 実験
スピニングディスク装置は、ＡＢＢ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｓｅｒｖｉｃｅにより所定の仕様（下記参照）に従って製造された。
鋼の品質：ＳＳ２３４３−０２（全ての指定の品目について）
ポリマー材料：ＰＴＦＥ、ポリカーボネート（ドーム保護）、ＥＰＤＭ（エチレンプロピレンジエンモノマー）、シリコーンゴム
ドーム高さ：９００ｍｍ
捕集鉢直径：２４００ｍｍ（水抜き溝を含む）
捕集鉢傾き：３°
ディスクの数：６
ディスク直径：２００ｍｍ
全体のディスクの厚さ：最大５．２ｍｍ
縁部でのディスクの厚さ：１２．４ｍｍ（１３５°の 傾きを含む）
上部圧力補償室直径（液体アガロース溶液用）：７３ｍｍ
上部圧力補償室高さ：６ｍｍ
分配針の数：６
針の内径：０．７ｍｍ。]
[0036] アガロース溶液は針により６個のディスクに供給した。１個の代わりに６個のディスクを使用することにより、最大容量(capacity)が増大する。アガロース流は６個のディスクの各々に対して同じであった。これは、各々のディスクに由来するビーズの大きさが同じであることを意味する。ディスクの速度範囲は３００１〜３０１０ｒｐｍ内に調節し、ドーム内の相対湿度は１００％であった。相対湿度が１００％未満であるとアガロース液滴から水が蒸発するおそれがある。]
[0037] ６９．７℃に調節した粘度３９７〜４２１ｍＰａｓのアリル化された６％アガロース溶液を用いてスピニングディスクに供給した。ディスクに対するアガロース溶液の流速は１２０〜１７０ｍＬ／ｍｉｎに調節した。捕集水の温度は１７．５〜２４．６℃であった。]
[0038] ５つのプロトタイプを製造した。エピクロロヒドリンで架橋した後のビーズの空隙率を表１に示す。プロトタイプの空隙率は様々なデキストランを用いて評価し、空隙容量はブルーデキストラン２０００を用いて得た。スピニングディスクプロトタイプは、免疫グロブリンがビーズを透過できないような空隙率を得るように製造した。これは、約１５００００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有する分子がビーズ中に拡散しないことを意味する。]
[0039] ５つのプロトタイプ全てで選んだ粒径は１９０μｍ±５μｍであった。表１の３つのプロトタイプ（Ａ、Ｄ、Ｅ）を使用して、分子量が約７００００ｇ／ｍｏｌ未満のタンパク質を捕集するが、免疫グロブリン（ヒトＩｇＧ）のような大きな分子はビーズ中に拡散してビーズのコア内のリガンドと相互作用することができないような媒体を製造した。]
[0040] 実施例２：宿主細胞タンパク質を捕集するように設計されたスピニングディスクビーズに基づく強アニオン交換媒体の調製
マトリックスの容量とは固定されたベッド容量をいう。グラムで表示するマトリックスの重量とは吸引乾燥重量をいう。これらのマトリックスは依然として水和された物質であるものと了解されたい。大規模の用途では、反応撹拌とは、磁石バー攪拌機を使用するとビーズの損傷が起こり易いので、吊したモーター駆動攪拌機を指していう。小規模の反応（２０ｍＬ又はｇ以下のゲル）は閉鎖されたバイアル中で実施し、撹拌とは振動台の使用をいう。]
[0041] 機能性の分析及びアリル化、エポキシド化の程度、又はビーズ中のイオン交換体基の置換の程度の決定には従来の方法を使用した。図２に、ＯＨ蓋の創成及びビーズのコア中の正に荷電リガンド（＝−Ｎ+（ＣＨ3）3）の結合に関して描いた一般的な合成手順を示す。] 図２
[0042] Ａ．スピニングディスクプロトタイプＡに基づくプロトタイプＱ１の調製（図２参照）
ＯＨ蓋−アリルゲルの調製
スピニングディスクプロトタイプＡのアリル活性化。スピニングディスクプロトタイプＡをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。フィルター上でゲル２５ｍＬの水を切り、秤量して三首丸底フラスコ中に入れた。ＮａＯＨ（１２．５ｍＬ、５０％溶液）を加え、機械的撹拌を開始した。ホウ水素化ナトリウム０．１ｇと、硫酸ナトリウム２．９ｇをフラスコに加え、スラリーを水浴で５０℃に加熱した。約１時間後２７．５ｍＬのＡＧＥを加えた。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約２０時間後スラリーをガラスフィルターに移し、酢酸（６０％）でｐＨを約７に調節した。次に、ゲルを蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。その後、アリル含有量を滴定により決定した（２６２μｍｏｌ／ｍＬ）。] 図２
[0043] 部分臭素化及びＮａＯＨ処理。アリル化されたゲル２２ｍＬを秤量してフラスコ中に入れ、８０ｍＬの蒸留水と１ｇの硫酸ナトリウムを加えた。次いで、激しく撹拌しながら０．３当量の臭素８９μＬをピペットで加えた。約５分後（臭素が消費されたとき）ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0044] 部分的に臭素化されたゲルを水と共にフラスコに移した。次いで、ＮａＯＨ（５０％溶液）をｐＨ＞１３になるまで加え、スラリーを５０℃に加熱し、一晩撹拌しながら放置した。約１８時間後、酢酸（６０％溶液）でｐＨを約７に調節した。その後、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0045] 次に、残留するアリル含有量を滴定により決定した（２００μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0046] ビーズのコアへのＱ基の結合
Ｑ結合（塩化トリメチルアンモニウム）。１０ｍＬの水を切ったゲル（部分臭素化しＮａＯＨ処理したゲル）を蒸留水と混合してビーカーに入れ、強力なオーバーヘッド撹拌を開始した。スラリーが残留する深い橙／黄色を有するまで臭素を加えた。１０分の撹拌後、スラリーが完全に変色するまでギ酸ナトリウム（約１．５ｇ）を加えた。次いで、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0047] 水を切り臭素化したゲルを秤量してフラスコに入れ、５ｍＬの塩化トリメチルアンモニウム（ＴＭＡ塩化物、６５％水溶液）と５ｍＬの２Ｍ ＮａＯＨを加えた。次いで、ＮａＯＨ（５０％溶液）でｐＨを約１２．５に調節した。その後、混合物を５０℃で一晩撹拌し続けた。２０時間後、ゲルを蒸留水で洗浄し、プロトタイプＱ１の塩素容量(chloride capacity)を滴定により決定した（１６０μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0048] Ｂ．それぞれスピニングディスクプロトタイプＥ及びＤに基づくプロトタイプＱ２及びＱ３の調製
スピニングディスクプロトタイプＥ及びＤに基づくＯＨ蓋−アリルゲルの調製
スピニングディスクプロトタイプＥのアリル活性化。スピニングディスクプロトタイプＥをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。フィルター上でゲル１００ｍＬの水を切り、秤量して三首丸底フラスコに入れた。ＮａＯＨ（５０ｍＬ、５０％溶液）を加え、機械的撹拌を開始した。ホウ水素化ナトリウム０．４ｇと、硫酸ナトリウム１１．４ｇをフラスコに加え、スラリーを水浴で５０℃に加熱した。約１時間後、１１０ｍＬのＡＧＥを加えた。その後、スラリーは激しく撹拌しながら一晩放置した。約２０時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、酢酸（６０％）でｐＨを約７に調節した。次に、ゲルを蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。次いで、アリル含有量を滴定により決定した（２９２μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0049] アリル化されたスピニングディスクプロトタイプＥの部分臭素化及びＮａＯＨ処理。アリル化されたゲル６０ｍＬを秤量してフラスコに入れ、３００ｍＬの蒸留水と５ｇの硫酸ナトリウムを加えた。次に、激しく撹拌しながら０．３当量の臭素２６９μＬをピペットで加えた。約５分後（臭素が消費されたとき）ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0050] 部分的に臭素化したゲルを水溶液と共にフラスコに移した。次に、ＮａＯＨ（５０％溶液）をｐＨ＞１３になるまで加え、スラリーを５０℃に加熱し、一晩撹拌し続けた。約１８時間後酢酸（６０％溶液）でｐＨを約７に調節した。次に、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0051] その後、残留するアリル含有量を滴定により決定した（２４５μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0052] スピニングディスクプロトタイプＤのアリル活性化。スピニングディスクプロトタイプＤをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。フィルター上でゲル５０ｍＬの水を切り、秤量して三首丸底フラスコに入れた。ＮａＯＨ（２５ｍＬ、５０％溶液）を加え、機械的撹拌を開始した。ホウ水素化ナトリウム０．２ｇと、硫酸ナトリウム５．７ｇをフラスコに加え、スラリーを水浴で５０℃に加熱した。約１時間後５５ｍＬのＡＧＥを加えた。その後、スラリーを激しく撹拌しながら一晩放置した。約２０時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、酢酸（６０％）でｐＨを約７に調節した。次いで、ゲルを蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。その後、アリル含有量を滴定により決定した（３３０μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0053] アリル化されたスピニングディスクプロトタイプＤの部分臭素化及びＮａＯＨ処理。アリル化されたゲル１０ｍＬを秤量してフラスコに入れ、９０ｍＬの蒸留水と１ｇの硫酸ナトリウムを加えた。次に、激しく撹拌しながら０．３当量の臭素５１μＬをピペットで加えた。約５分後（臭素が消費されたとき）ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0054] 部分的に臭素化したゲルを水と共にフラスコに移した。次に、ＮａＯＨ（５０％溶液）をｐＨ＞１３になるまで加え、スラリーを５０℃に加熱し、一晩撹拌し続けた。約１８時間後酢酸（６０％溶液）でｐＨを約７に調節した。次いで、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0055] その後、残留するアリル含有量を滴定により決定した（２７７μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0056] ビーズのコアへのＱ基の結合
スピニングディスクプロトタイプＤのＱ結合（プロトタイプＱ２）。１０ｍＬの水を切ったゲル（部分臭素化しＮａＯＨ処理したスピニングディスクプロトタイプＤ）をビーカー中で蒸留水と混合し、強力なオーバーヘッド撹拌を行った。スラリーが持続する深い橙／黄色を示すまで臭素を加えた。１０分の撹拌後、スラリーが完全に変色するまでギ酸ナトリウム（約１．５ｇ）を加えた。次に、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0057] 水を切り臭素化したゲルを秤量してフラスコに入れ、５ｍＬの塩化トリメチルアンモニウム（ＴＭＡ塩化物、６５％水溶液）と５ｍＬの２Ｍ ＮａＯＨを加えた。次に、ＮａＯＨ（５０％溶液）でｐＨを約１２．５に調節した。その後、混合物を５０℃で一晩撹拌し続けた。２０時間後ゲルを蒸留水で洗浄し、ゲルの塩素容量を滴定により決定した（１７２μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0058] スピニングディスクプロトタイプＥのＱ結合（プロトタイプＱ３）。１０ｍＬの水を切ったゲル（部分的に臭素化しＮａＯＨ処理したスピニングディスクプロトタイプＥ）をビーカー中で蒸留水と混合し、強力なオーバーヘッド撹拌を行った。スラリーが持続する深い橙／黄色を示すまで臭素を加えた。１０分の撹拌後、スラリーが完全に変色するまでギ酸ナトリウム（約１．５ｇ）を加えた。その後、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0059] 水を切り臭素化したゲルを秤量してフラスコに入れ、５ｍＬの塩化トリメチルアンモニウム（ＴＭＡ塩化物、６５％水溶液）と５ｍＬの２Ｍ ＮａＯＨを加えた。次いで、ＮａＯＨ（５０％溶液）でｐＨを約１２．５に調節した。その後、混合物を５０℃で一晩撹拌し続けた。２０時間後、ゲルを蒸留水で洗浄し、ゲルの塩素容量を滴定により決定した（１８２μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0060] 実施例３：スピニングディスクプロトタイプＥに基づく３つの弱アニオン交換媒体（プロトタイプＤＥＡＥＩ〜III）の調製
スピニングディスクプロトタイプＥに基づくＯＨ−蓋−アリルゲルの調製
スピニングディスクプロトタイプＥのアリル活性化。スピニングディスクプロトタイプＥをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。フィルター上でゲル１００ｍＬの水を切り、秤量して三首丸底フラスコに入れた。ＮａＯＨ（５０ｍＬ、５０％溶液）を加え、機械的撹拌を開始した。ホウ水素化ナトリウム０．４ｇと、硫酸ナトリウム１１．４ｇをフラスコに加え、スラリーを水浴で５０℃に加熱した。約１時間後、１１０ｍＬのＡＧＥを加えた。次に、スラリーを激しく撹拌しながら一晩放置した。約２０時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、酢酸（６０％）でｐＨを約７に調節した。次いで、ゲルを蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。その後、アリル含有量を滴定により決定した（２９２μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0061] アリル化されたスピニングディスクプロトタイプＥの部分臭素化及びＮａＯＨ処理。アリル化されたゲル６０ｍＬを秤量してフラスコに入れ、３００ｍＬの蒸留水と５ｇの硫酸ナトリウムを加えた。次に、激しく撹拌しながら０．３当量の臭素２６９μＬをピペットで加えた。約５分後（臭素が消費されたとき）ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0062] 部分的に臭素化したゲルを水溶液と共にフラスコに移した。次に、ＮａＯＨ（５０％溶液）をｐＨ＞１３まで加え、スラリーを５０℃に加熱し、撹拌しながら一晩放置した。約１８時間後、酢酸（６０％溶液）でｐＨを約７に調節した。その後、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0063] その後、残留するアリル含有量を滴定により決定した（２４５μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0064] ビーズ−プロトタイプＤＥＡＥＩ〜IIIのコアへのＤＥＡＥデキストランの結合
１５ｍＬの水を切ったゲル（部分的に臭素化しＮａＯＨ処理したスピニングディスクプロトタイプＥ）をビーカー中で蒸留水と混合し、強力なオーバーヘッド撹拌を行った。臭素は、スラリーが持続する深い橙／黄色を示すまで加えた。１０分の撹拌後、スラリーが完全に変色するまでギ酸ナトリウム（約１．５ｇ）を加えた。次に、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0065] 水を切り臭素化したゲルの５ｍＬの部分を下記に従ってＤＥＡＥデキストラン溶液（２５ｍＬの水に溶解した１５ｇＤＥＡＥデキストラン、総量；３７ｍＬ）と混合し、室温で０．５ｈ撹拌した後、０．６ｍＬの５０％ＮａＯＨと０．１ｇのＮａＢＨ4を加え、５０℃で１７ｈ撹拌した。水、０．５Ｍ ＨＣｌ及び１ｍＭ ＨＣｌで洗浄した後、Ｃｌ-容量を滴定により決定した（表４参照）。
プロトタイプＤＥＡＥ−Ｉ：１ｍＬのＤＥＡＥデキストラン溶液＋９ｍＬの水
プロトタイプＤＥＡＥ−II：４ｍＬのＤＥＡＥデキストラン溶液＋６ｍＬの水
プロトタイプＤＥＡＥ−III：１０ｍＬのＤＥＡＥデキストラン溶液。]
[0066] 実施例４：スピニングディスクプロトタイプＡに基づく弱カチオン交換体（プロトタイプＣＯＯ-）の調製
スピニングディスクプロトタイプＡに基づくＯＨ−蓋−アリルゲルの調製
スピニングディスクプロトタイプＡのアリル活性化。スピニングディスクプロトタイプＡをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。フィルター上でゲル２５ｍＬの水を切り、秤量して三首丸底フラスコに入れた。ＮａＯＨ（１２．５ｍＬ、５０％溶液）を加え、機械的撹拌を開始した。ホウ水素化ナトリウム０．１ｇ、及び硫酸ナトリウム２．９ｇをフラスコに加え、スラリーを水浴で５０℃に加熱した。１時間の平衡化時間の後、２７．５ｍＬのＡＧＥを加えた。その後、スラリーを激しく撹拌しながら一晩放置した。約２０時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、酢酸（６０％）を用いてｐＨを約７に調節した。次に、ゲルを蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。その後、アリル含有量を滴定により決定した（２６２μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0067] アリル化されたスピニングディスクプロトタイプＡの部分臭素化及びＮａＯＨ処理。アリル化されたゲル２２ｍＬを秤量してフラスコに入れ、８０ｍＬの蒸留水と１ｇの硫酸ナトリウムを加えた。次に、激しく撹拌しながら０．３当量の臭素８９μＬをピペットで加えた。約５分後（臭素が消費されてしまったとき）ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0068] 部分的に臭素化したゲルを水と共にフラスコに移した。次いで、ＮａＯＨ（５０％溶液）をｐＨ＞１３まで加え、スラリーを５０℃に加熱し、一晩撹拌し続けた。約１８時間後酢酸（６０％溶液）を用いてｐＨを約７に調節した。次に、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0069] その後、残留するアリル含有量を滴定により決定した（２００μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0070] ビーズのコアへのリガンドの結合
Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−ホモシステインの結合。１０ｍＬの水を切ったゲル（部分的に臭素化しＮａＯＨ処理したスピニングディスクプロトタイプＡ）をビーカー中で蒸留水と混合し、強力なオーバーヘッド撹拌を行った。スラリーが持続する深い橙／黄色を示すまで臭素を加えた。１０分の撹拌後、スラリーが完全に変色するまでギ酸ナトリウム（約１．５ｇ）を加えた。その後、ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。]
[0071] Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−ホモシステインチオラクトン（３．６４ｇ、１６．４７ｍｍｏｌ）を秤量して丸底フラスコに入れ、撹拌しながらＮａＯＨ（６ｍＬ、５０％溶液）と蒸留水（４０ｍＬ）を加えた。次に、溶液を４０℃に加熱し、３時間撹拌し続けた。次いで、水を切り臭素化したゲルを溶液に移し（混合物のｐＨは１２．９と測定された）、温度を５０℃まで上げた。約２２時間後ゲルをガラスフィルター上で蒸留水（４×１００ｍＬ）により洗浄した。この媒体（コアリガンドの構造は下記参照）のイオン容量(ionic capacity)を滴定した（１８４μｍｏｌ／ｍＬ）。]
[0072] 宿主細胞タンパク質の捕集用に設計されたスピニングディスク媒体に基づくモノクローナル抗体の精製
Ｑ基（−Ｎ+（ＣＨ3）3）の結合のための合成の手順を図２に示す。] 図２
[0073] この試験手順の主な目的は、約７００００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するタンパク質がビーズのコア中に拡散することができる一方で、ＩｇＧはクロマトグラフ条件でビーズ内に拡散することができないということを検証することであった。従って、スピニングディスクプロトタイプの破過容量(breakthrough capacity)を、様々な大きさのタンパク質で試験した。４種類の異なる試験タンパク質（ＩｇＧ、ＢＳＡ、オボアルブミン及びラクトアルブミン）を使用した。]
[0074] 実験
破過容量に関して検討すべき媒体をＨＲ ５／５カラムに詰め、緩衝溶液で平衡化した後試料溶液を０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速でカラムに通してポンプで送った。破過容量は、最大ＵＶ検出器信号（２８０ｎｍ）の１０％で評価した。最大ＵＶ信号は試験溶液を直接検出器にポンプで送ることによって評価した。吸収最大（Ｑb10%）の１０％における破過容量は次式に従って計算した。]
[0075] Ｑb10%＝（ＴR10%−ＴRD）×Ｃ／Ｖc
式中、ＴR10%は吸収最大の１０％における保持時間（ｍｉｎ）であり、ＴRDは系の空隙容量時間（ｍｉｎ）であり、Ｃは試料の濃度（４ｍｇタンパク質／ｍＬ）であり、ＶCはカラム容量（ｍＬ）である。]
[0076] ビーズのコアに結合されたリガンドに応じて次の２種類の異なる吸着緩衝液を使用した：
１．アニオン交換体用の吸着緩衝液：２５ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）
２．カチオン交換体用の吸着緩衝液：０．１５ＭのＮａＣｌを添加した５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）。]
[0077] 試料
使用した試料はヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ、Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン及びラクトアルブミンであった。これらのタンパク質は４ｍｇ／ｍＬの濃度で吸着緩衝液に溶解し、一時に１種類のみのタンパク質をカラムに適用した。]
[0078] 計器
装置
ＬＣ系：ＡＫＴＡエクスプローラー１０ＸＴ又は同等物(or equal)
ソフトウェア：ＵＮＩＣＯＲＮ
カラム：ＨＲ ５／５
計測パラメーター
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
検出器セル：１０ｍｍ
波長：２８０ｎｍ
ＵＮＩＣＯＲＮ法
使用した主要な方法を以下に記す：
0.00 BaseCV1.00 [mL] #Column volume [mL] Any
0.00 Block Start conditions
0.00 Base SameAsMain
0.00 Wave length 280 [nm] 254 [nm] 215 [nm]
0.00 Averaging Time 2.56 [sec]
0.00 Alarm Pressure Enable 3.00 [MPa] 0.00 [MPa]
0.00 End Block
0.00 Block Column position
0.00 Block Equilibration
0.00 Base SameAsMain
0.00 PumpAInlet A1
0.00 BufferValveA1 A11
0.00 Flow 0.3 [mL/min]
1.00 Set Mark ()#column name
3.9 AutoZeroUV
5.0 #Equilibration volume End Block
0.00 Block Sample loading
0.00 Base volume
0.00 Flow (1)#flow rate [mL/min]
0.00 Set Mark ()#sample
0.00 InjectionValve Inject
0.00 Watch UV Greater Than (100) #20 percent maxabs [mAu] ENDBLOCK
49.00 InjectionValveLoad
49.00 End Block
0.00 Block Column wash
0.00 Base SameAsMain
0.00 InjectionValve Load
0.00 Watch Off UV
0.00 PumpAInlet A1
0.00 BufferValveA1 A11
0.00 Watch UV Less Than (20) #5 percent [mAu] END BLOCK
20.00 End Block
0.00 Block Gradient elution
0.00 Base SameAsMain
0.00 PumpBInlet B1
0.00 Gradient 100 [%B] 2.00 [base]
0.00 Flow 0.30 [mL/min]
10.00 Gradient 0.00 [%B] 0.00 [base]
10.00 End Block
0 Block Reequilibration
0.00 End Method

実施例５：強アニオン交換プロトタイプの破過容量
スピニングディスクプロトタイプＡ（表１）に基づき、ビーズのコア内にＱ基を有する１つのプロトタイプ（Ｑ１）を図２に従って製造した。４種類のタンパク質に対する破過容量を試験した結果を表２に示す。容量は２つの最も大きいタンパク質ＩｇＧとＢＳＡに対して低く（＜２ｍｇ／ｍＬ）、オボアルブミンとラクトアルブミンに対する容量はそれぞれ６８ｍｇ／ｍＬと８９ｍｇ／ｍＬであった。] 図２
[0079] この結果は、ＩｇＧがビーズ内に拡散しなかったこと、従ってその破過容量は低いことを明らかに示している。これは、１２６０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有するデキストランが０．０２１より低いＫav値を示す表１に掲げた結果と合致している。また、この結果は、約４４０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する宿主細胞タンパク質がビーズのコア内のリガンドにより捕集されることも示している。]
[0080] それぞれスピニングディスクプロトタイプＤ及びＥ（表１）に基づく２つのプロトタイプ（Ｑ２及びＱ３）も試験した。いずれのプロトタイプも図２に従って（さらなる詳細については合成の欄参照）ビーズのコア内でＱ基により改変された。] 図２
[0081] これらのプロトタイプもＩｇＧを排除し、オボアルブミンに対して高い破過容量を示した。また、比較的に高い容量（８．８ｍｇ／ｍＬ）がスピニングディスクプロトタイプＥに基づくアニオン交換体に対して得られたことも明白であった。これは、このディスクプロトタイプで、６６７００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するデキストランに対してプロトタイプＤと比較してより高いＫav値が得られたことを示す表１に掲げたデータと合致している。プロトタイプＥの結果は、ＢＳＡがビーズ中に拡散しアニオン交換リガンドと相互作用することができるということを示している。従って、より高いＢＳＡ破過容量を得るために最適化されたリガンド構造を含む新しいアニオン交換体が製造された（下記参照）。]
[0082] 実施例６：弱アニオン交換プロトタイプの破過容量
ビーズの内部にＤＥＡＥ−デキストランを結合することにより、エキステンダーを介してリガンド（ＤＥＡＥ）をマトリックスに結合した。この場合、デキストランがエキステンダーであり、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）がリガンドである。ＤＥＡＥ−デキストランをビーズの内部に結合した（さらなる詳細については合成の欄参照）３種のプロトタイプ（表４）を製造した。全てのプロトタイプは図３に示すようなＯＨ−蓋を備えていた。] 図３
[0083] 表５によると、全てのプロトタイプが非常に良好な結果を生じた。最良のプロトタイプ（ＤＥＡＥ−III）の場合、ＩｇＧ、ＢＳＡ及びオボアルブミンの破過容量はそれぞれ０．９、１８１、＞１９０ｍｇ／ｍＬであった。表５に挙げた結果は優れており、ＢＳＡよりさらに大きいタンパク質が高い破過容量を有する一方で、ＩｇＧに対する破過容量が２ｍｇ／ｍＬより低いことも示している。]
実施例

[0084] 実施例７：カチオン交換プロトタイプ（プロトタイプＣＯＯ-）の破過容量
ビーズ（スピニングディスクプロトタイプＡ、表１）のコア内に高塩リガンドを含むプロトタイプ（プロトタイプＣＯＯ-）（合成の欄参照）を試験した。ＩｇＧ及びオボアルブミンに対する破過容量を検討し、移動相は塩（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）を加えた酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）であった。塩は、高い破過容量がオボアルブミンに対して比較的に高いイオン強度でも得ることができることを検証するために加えた。ＩｇＧに対する最大容量は１．７ｍｇ／ｍＬと記録され、オボアルブミンに対しては約３９ｍｇ／ｍＬと記録された。ビーズのコア内の高い塩リガンドは予期された通りオボアルブミンを吸着し、比較的に高い容量が観察された。さらに、ＩｇＧに対する破過容量は期待された通り低かった。]

权利要求:

請求項1
スピニングディスク法でのポリマービーズの選択的な製造方法であって、上記ビーズが、１５００００ｇ／ｍｏｌよりも大きな分子がビーズ内に拡散するのを阻止する空隙率を有しており、以下の工程：ａ）３５０〜４５０ｍＰａｓの粘度を有する４〜８％の多糖類溶液を、６５〜７５℃で、３００１〜３０１０ｒｐｍにおいて１以上のスピニングディスクに供給して多糖類ビーズを形成する工程と、ｂ）生成した多糖類ビーズを捕集浴に捕集する工程であって、捕集の温度を１５〜２７℃、好ましくは１７．５〜２４．６℃で変化させることによって多糖類ビーズの空隙率を制御する工程とを含む方法。
請求項2
前記多糖類が、アガロース、カラゲナン、デキストラン、アルギン酸塩、ペクチン、デンプン及びガラクトマンナンから選択される、請求項１記載の方法。
請求項3
工程ａ）における多糖類ビーズが７０℃の６％アガロース溶液であり、３９７〜４２１ｍＰａｓの粘度を有する、請求項２記載の方法。
請求項4
工程ａ）において多糖類溶液を１２０〜１７０ｍＬ／ｍｉｎの流速で１以上のスピニングディスクに供給する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
請求項5
前記多糖類ビーズを活性化する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
請求項6
工程ｂ）の後に多糖類ビーズを架橋する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
請求項7
工程ｂ）の後に多糖類ビーズに蓋又は外層を設ける、請求項５又は請求項６記載の方法。
請求項8
前記多糖類ビーズをアリル化し、部分的に臭素化し、ＮａＯＨで処理してコア多糖類ビーズ上に蓋を形成する、請求項７記載の方法。
請求項9
コア多糖類ビーズがリガンドを有する、請求項７又は請求項８記載の方法。
請求項10
前記リガンドがイオン交換リガンドである、請求項９記載の方法。
請求項11
前記多糖類ビーズがアガロースビーズであり、イオン交換リガンドがエキステンダーを有する弱アニオン交換リガンドである、請求項１０記載の方法。
請求項12
請求項８乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法で製造された分離媒体であって、リガンドがイオン交換体である、分離媒体。
請求項13
前記リガンドがエキステンダーを有する弱アニオン交換体である、請求項１２記載の分離媒体。
請求項14
前記多糖類ビーズがアガロースビーズであり、弱アニオン交換体がＤＥＡＥ（ｍｗ５０００００）のような大きな荷電ポリマーであり、エキステンダーがデキストランである、請求項１３記載の分離媒体。
請求項15
所望の生体分子を不要な生体分子からクロマトグラフ又はバッチ式に分離するための、請求項１２乃至請求項１４のいずれか１項記載の分離媒体の使用。
請求項16
不要な分子がビーズ内に拡散し、所望の分子がビーズ内に拡散しない、請求項１５記載の使用。
請求項17
所望の生体分子がＩｇＧ又はモノクローナル抗体である、請求項１５又は請求項１６記載の使用。
請求項18
所望の分子がビーズ内に拡散し、不要な分子がビーズ内に拡散しない、請求項１５記載の使用。
請求項19
所望の分子が分子量＜６００００ｇ／ｍｏｌの存在量の少ないタンパク質である、請求項１８記載の使用。
請求項20
前記存在量の少ない分子がバイオマーカーである、請求項１９記載の使用。